。如病原基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用鑄造試驗(yàn)儀器位置等?div id="m50uktp" class="box-center"> ？杀３旨?xì)胞或組織的完全性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶DNA所在的位置進(jìn)行基因擴(kuò)增。不但可以檢測(cè)到靶DNA，還能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置。于份子和細(xì)胞水平上研究疾病的病發(fā)機(jī)理和臨床進(jìn)程及病理的轉(zhuǎn)變有側(cè)重大的實(shí)用價(jià)值。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀
在普通PCR儀設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上增加熒光信號(hào)激起和收集系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，構(gòu)成了具有熒光定量PCR功能的儀器。其PCR擴(kuò)增原理和普通PCR擴(kuò)增原理相同，在PCR擴(kuò)增時(shí)加入的引物是利用同位素、熒光素等進(jìn)行標(biāo)記，使用引物和熒光探針同時(shí)與模板特異性結(jié)合擴(kuò)增。擴(kuò)增的結(jié)果通過(guò)熒光信號(hào)收集系統(tǒng)實(shí)時(shí)收集信號(hào)連接輸送到計(jì)算機(jī)分析處理系統(tǒng)，得出量化的實(shí)時(shí)結(jié)果輸出。
熒光定量PCR儀有單通道，雙通道和多通道之分。當(dāng)只用1種熒光探針標(biāo)記的時(shí)候，選用單通道；有多種熒光標(biāo)記的時(shí)候使用多通道。單通道也能夠檢測(cè)多熒光的標(biāo)記和目的基因表達(dá)產(chǎn)物，由于1次只能檢測(cè)1種目的基因的擴(kuò)增量，需屢次擴(kuò)增才能檢測(cè)完不同的目的基因片斷的量。多通道利于做多重PCR，實(shí)現(xiàn)1次檢測(cè)多種目的基因的功能。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀主要利用于臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等。
PCR儀常見問(wèn)題及回答
1. cDNA產(chǎn)量的很低可能的緣由：*RNA模板質(zhì)量低*對(duì)mRNA濃度估計(jì)太高*反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足*同位素磷32過(guò)期*反應(yīng)體積過(guò)大，不應(yīng)超過(guò)50μl2. 擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒有條帶或條帶很淺*多見的緣由在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系*與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)*建議在實(shí)驗(yàn)中加入對(duì)比RNA*第1鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過(guò)1/10*建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物（GSP）用于第1鏈合成。由于RNA模板存在2級(jí)結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能致使GSP沒法與模板退火；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶沒法從此引物進(jìn)行有效延伸。*目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中斷位點(diǎn)，可以試用以下方法解決：a. 將第1鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。b. 使用隨機(jī)6聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行第1鏈反應(yīng)。3. 產(chǎn)生非特異性條帶*用RT陰性對(duì)比檢測(cè)是不是被基因組DNA污染。如果RT陰性對(duì)比的PCR結(jié)果也顯示一樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。*在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將致使產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，下降鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。*由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將致使產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。
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